為什么生物指示劑暴露于滅菌循環后依然存活？

  當生物指示劑暴露在滅菌循環內，預期所有的測試物品都無菌。滅菌過程中所有關鍵參數都達標了。生物指示劑被激活和培養。在接下來幾天的培養期中，暴露的生物指示劑結果被記錄下來。希望除了陽性對照之外，你永遠不會看到陽性結果 (黃色)。但如果有一天你把樣本從培養器里拿出來，發現了一個意想不到的陽性(黃色)指示劑，你該怎么辦呢?

  最近我們收到一位客戶的來信，他在使用自含式生物指示劑時遇到了讓他感到有所顧慮的情況。滅菌循環是在134°C下7分鐘。暴露的指示劑培養48小時檢測為陰性(紫色)。然而一些暴露的指示劑在隨后的48小時觀察中，檢測呈陽性(黃色)。最后，客戶提到過去他們使用每支含菌量105時，沒有經歷過“失敗"。從那以后他們就改用了106，偶爾會看到48小時后呈現陽性結果的情況 。

  說明書上顯示制造商必須遵守FDA縮短培養時間（RIT）的標準，方能標注生物指示劑培養48小時即可出結果（或少于7天的培養期）。測試必須一式三份使用至少三個單獨批次，要求100個生物指示劑暴露于部分滅菌循環，使得100個暴露的指示劑中有30至80個呈陽性。

將暴露的生物指示劑進行培養，并在七天內定期對陽性指示劑進行記錄。如果48小時內記錄的陽性指示劑數量除以7天內的陽性指示劑數量結果大于0.97，那么生物指示劑培養48小時即可出結果的說法就是成立的。例如，到了第7天如果總計觀察到78個陽性指示劑，那么至少需要在48小時內記錄76個陽性。76 ÷ 78 =0.974 。如果在48小時內檢測到75個或更少數量的指示劑呈陽性。那就說明產品沒有通過 RIT測試，75÷78=0.962。

  了解了RIT測試的具體情況，可以看出如果培養時間超過標簽要求，可能會有更多指示劑呈陽性。然而，RIT測試的目標是“量變區"，有些暴露的指示劑為陰性，有些為陽性。常規滅菌循環不針對該區域開發。經驗證和批準的滅菌循環旨在實現致死劑量遠超孢子滅活的量變區。有效的滅菌循環實現的致死量遠超量變區。

  當達到這個量變區時，每個指示劑活孢子數量已降至0、1、2或極少有存活的受損孢子。存活孢子數量為0的指示劑在48小時、7天或以上檢測為陰性。具有一個或多個存活孢子的指示劑通常在48小時或更短時間內呈陽性。最后要考慮的是，指示劑如果有一個或兩個受損的孢子可能無法生長，修復消毒劑造成的損害，生長、繁殖、代謝培養基中的營養物質，從而產生酸性副產物，導致pH指示劑變成黃色。對于這些指示劑而言，測試結果會呈陰性還是陽性是有疑問的。此外，由于孢子的嚴重損傷，生長和繁殖可能會延遲，從而在48小時的時間內呈陰性結果，但超過48小時則最終變成黃色。這種現象只會發生在量變區。更長的滅菌時間能成功殺死所有孢子。如上所述，如果沒有孢子存活，指示劑將在七天或更長時間后依然檢測為陰性。

  為了評估有疑問批次的指示劑的抗性，我們對數據進行回顧，有證據表明48小時后可能出現額外的陽性反應。在抗力儀(BIER)中處理了總共940個EZTest指示劑，來評估121°、124°、129°、132°、134°和135°C溫度下的D值。在消耗的940個指示劑中，48小時后僅出現6個額外的陽性指示劑。對于在48小時觀察到失活的所有暴露的指示劑而言，在7天的培養過程中沒有出現陽性結果。

  在134°C下進行D值評估時，2.0、2.5、3.0和3.5分鐘時實現了對孢子的殺滅。正如你所見，如果滅菌達到規定的致死劑量（對應于134°C飽和蒸汽下暴露7.0分鐘的生物指示劑，在任何情況下客戶都不會看到陽性結果。這個客戶在48小時后發現了額外的陽性指示劑，這清楚地表明滅菌循環產生的致死劑量與量變區效果相當。客戶的所有暴露指示劑在48小時的時候均呈陰性，48小時后少數呈陽性。這表明致死劑量接近量變區的終點，與我們1.5或2.0分鐘BIER循環的情況相似。  

問題仍然存在，為什么指示劑在134°C, 7分鐘循環測試中呈陽性?

 抗性準確的生物指示劑在此滅菌循環下可能出現陽性結果的原因有幾個：

  1.溫度探頭顯示134°C，但存在錯誤，滅菌室內的溫度其實比這低很多

  2.溫度探頭顯示134°C，是準確的，但不代表放置指示劑的環境中全部都是這個溫度。負載內的包裝和/或位置可能會阻礙蒸汽滲透到指示劑的位置或指示劑的位置有空氣。

  3.壓力探頭指示的壓力與飽和蒸汽相對應條件在134°C(即44.10 psia)，但其實有誤差，滅菌室內實際上大多數位置的壓力是不同的。

  4.壓力探頭是準確的，但由于在負載內的包裝和/或位置的原因，讀數不能代表放置指示劑的環境內的普遍情況

  從滅菌室(以及EZTest指示劑)中去除空氣和/或通往EZTest指示劑的蒸汽受到了阻礙。在高溫和較短的滅菌循環下，這是最常見的問題。由于滅菌循環使用的包裝原因，這個問題會更嚴重。孢子就會對整體的環境作出反應，綜合的殺滅效力會比任何測量方式都要精確。(溫度和壓力探頭無法區分飽和蒸汽和干熱。)自含式指示劑EZTest可以很好地檢測到滅菌循環不足，因為它的功能就像一個氣阱。不像STRIP BI的可滲透玻璃紙包裝，EZTest進行空氣/蒸汽交換的位置是通過排氣帽進行的。由于氣體交換有限，EZTest創造了一個“最壞的環境"，因此可以比任何其他類型的生物指示劑更好地檢測排氣/蒸汽滲透效率低下的情況。

 另一種可能是暴露和培養的指示劑在培養期內被污染了。污染物導致培養基顏色變化。出現假陽性，其實孢子已經殺滅了。在培養期內晃動、跌落或倒置激活的指示劑都可能導致蓋子里的濾紙片變濕，引入污染物的可能性增加。 

  處理后污染是必須考慮的情況。然而,在這個特定的案例中，有一種說法降低了這種情況的可能性。在過去，X10^5的含菌量用戶從未遇到過這種問題。換成X10^6 含菌量的EZTest以后才出現這個問題。這表明正在使用的滅菌循環已經提供了一定致死劑量，能夠使含菌量較低的指示劑不被激活。當含菌量增加十倍后，致死劑量更高，只是偶爾有一個孢子存活。

  從本質上說，生物指示劑的表現符合它的預期。這就是生物指示劑的使用目的，所以生產無菌產品的企業必須使用生物指示劑;它證明了滅菌室里已經實現了殺滅孢子的條件。結果是一致的。記住，“無菌"一詞的定義是所有活的微生物都不存在，而不是根據溫度、壓力和Fo值來確定。如果您發現自己的指示劑處于探頭所指示能殺滅細菌的情況，但結果卻呈陽性，記住不論預期的殺滅劑量是怎樣的，微生物原本是在滅菌室，現在是在培養器里生長。很明顯，指示劑受到的滅菌效力是不夠的。